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精子分离技术的进展

20世纪伊始，就有许多有关分离X精子(具有X染色体的精子)和Y精子(具有Y染色体的精子)的研究报告。近年来，美国、日本等国相继报道分离人和牛的X、Y精子获得成功，然而其实验效果的重复性极低。本文仅就最近有关X、Y精子的分离研究进展情况作以扼要的介绍。

一、X精子与Y精子的不同点

1.Y精子的F小体

1968年，Caspersson等用芥子奎吖因染色观察雄性染色体时，发现Y染色体的长臂散发较其他染色体为强的荧光，而且在细胞静止期的Y染色体上具有散发强荧光的小点，称之为F小体(F—body)。Barlow和Vosa(1970)用同样的染色法证明人精子的39—47％具有这种F小体。因此，认为具有F—body的精子就是Y精子，人们企图以此为依据分离识别X、Y精子。最初报道这种F小体仅存在于人和大猩猩的精子中，后来有人报道在家畜精子中亦有这种F小体。然而，在人和家畜尚没有充足的实验证据能够证明具有F—body的精子就是Y精子，反之就是X精子。

2.精子头部的大小

处于分裂中期的哺乳动物细胞核中，通常X染色体较Y染色体大得多。譬如牛的X染色体的面积为7.85u2，Y染色体则为3.47u2，前者几乎为后者两倍。不难推测，X精子的头部要比Y精子的头部大。测定射出精子的头部大小，可把精子分为长头部和短头部两类。但是，迄今为止没有证据说明这两类精子分别就是X、Y精子。

精子头部在附睾内成熟时，特别是核物质脱水浓缩，所以精子依不同成熟阶段其头部大小也具有差异。而且射出精子的成熟度也不尽一致。另外，射出精子的大小，还可依浮游液的渗透压不同而发生变化。在低渗生理盐水中，牛精子头部可膨大为正常精子的3倍，相反在高渗溶液中，牛精子头部可由25um3缩至20um3。而且，具有F小体和不含F小体的人精子核面积几乎无差异。

3.精子的重量、比重

X精子和Y精子的DNA含量具有差异。应用激光及荧光原理的流式细胞光度术测定精子的DNA，证明其含量呈双峰性分布。X、Y精子的NNA含量差，可由单倍体DNA平均含量的百分率推测，几乎所有动物都为2.5—4.5％。即其DNA含量差。相当于精子头部半径差的1％。这种微小差异能够影响浮游液中的精子运动及沉降速度是不可思议的。

如果说X精子和Y精子的重量不同，那么首先必须假定所有精子除DNA以外，组成精子头部及尾部的物质比重相等。由假设精子头部核蛋白含量以及含水量一定情况下，算出X精子和Y精子的比重分别为1.1141g/cm3、1.1134g/cm3，而且精子比重随其成熟越来越大。

4.表面膜电位

一般认为，细胞膜电位受与糖蛋白结合的唾液酸含量的影响，而细胞膜的核糖酸(ribitol)的电荷，与其电泳时的泳动速度无关。

射出精液中的精子带有负电荷，但是X精子与Y精子的膜电位是否具有差异尚无证据。精子膜的带电量依其成熟或老化过程的不同而有变化。已知附睾尾的精子膜电位较附睾头的精子膜电位高。随着精子的老化，其膜电位降低，所以活精子的膜电位要较死精子的膜电位高。而且精子的膜电位依其部位不同亦有差异，其尾部的电位较头部为高。

有人报道，使用中性缓冲液电泳时，X精子向阳极移动的速度要较Y精子快，然而亦有与之结果相反的报告。DNA是否影响表面膜电位，对此尚不清楚。

5.精子的运动性

有人报道，具有F小体的精子较其他精子呈现活泼的直线前进运动。Ericsson等(1973)报道，由血清白蛋白层析柱分离出的精子，较原精液的活率高，并且指出这些分离出精子的83％具有F小体。但是，对此追试结果不尽一致。

6.精子的抗原性

由同品系雌雄小鼠间进行皮肤移植实验时，发现只有雄性的皮肤移向雌性小鼠时，才发生排斥反应。这种排斥反应，与细胞中Y性染色体的存在有关，所以相应称此抗原为H－Y抗原(Histocompatibiliy—y—antigen)。H—y抗原受Y染色体上的睾丸决定基因所调控。

精子也有H一Y抗原，主要存在于精子头帽部，在头部后缘，颈部以及尾部几乎没有。精子的H－Y抗原，并非精子自体合成，所以在X精子和Y精子都有这种H－Y抗原。对其来源，有人认为来自于支持细胞，亦有人认为与精原细胞的分化有关。

目前利用H－Y抗体处理精子来控制性别的实验，尚未获得成功。从理论上讲，H—Y抗原量在X精子和Y精子间可能具有差异，但是，对此Ohno和Wachtel(1978)提出了否定的结果。

二、X、Y精子的分离实验

人们试图利用X、Y精子的上述不同点，分离X精子和Y精子以达到控制性别的目的。分离方法有沉降法、密度梯度离心法、电泳法和免疫法等等。

1.沉降法

这是在假定X精子的重量较Y精子大的基础上，根据重力来分离两类精子的方法。有多这种沉降分离的研究报告，但是都没有得到令人满意的效果。

Schilling(1971)报道，把牛精子放入卵黄缓冲液中进行沉降，收集最下层的精子进行输精结果，获得了70％是母犊牛的成绩。Eriosson等(1973)把净洗的人精子用白蛋白溶液反复沉降结果，分离出的精子具有F小体的百分率为83％。Beernink和Ericsson(1982)报道，用牛血清白蛋白浓度梯度法分离人的X、Y精子获得成功。然而，Beal(1984)采用这种方法分离牛精子的实验结果却不甚理想。

2.密度梯度离心法

这一方法也是根据X、Y精子重量或比重不同的特点，利用密度梯度进行平衡沉淀的方法，多少与沉降法有所不同。

密度梯度的制作，通常使用蔗糖、乳糖等糖类，而最近有人则使用高分子的水溶性聚蔗糖液(Fiocll)。Rohde等(1975)报道，用蔗糖密度梯度法分离人精子的结果，离心后位于上层的大多数精子具有F小体，而下层的精子则很少含有F小体。Shastry等(1977)用Ficoll离心法分离人精子的结果，分离精子的73％具有F小体，然而其效果未得到重复。

兼子等(1983)用胶体硅胶聚乙烯吡咯烷酮密度梯度液，(Percoll)离心分离人的X、Y精子也得到较理想的效果。但是，使用同样方法分离牛精子的结果，却具有不同的报道。

3.电泳法

大约在50年前开始就有人试图利用电泳原理分离X、Y精子，然而迄今为止，其效果仍不太理想。如上所述，精子的膜表面带有负电荷，通常在中性缓冲液中向阳极泳动。有的精子尾部带电量较头部大，一般认为尾部带电量大的精子就是X精子。

有人用电泳法分离人精子的结果，发现具有F小体的精子泳向阳极，不含F小体的精子泳向阴极。Kaneko等(1983)用无载体电泳法(freefjlow electrophoresis)分离X、Y精子的结果，指出泳动精子呈双向性分布，而且检测F小体的结果证明，近阳极端的精子为X精子，近阴极端的精子则为Y精子。桀田等(1986)同样用无载体电泳法分离牛的X、Y精子，并把泳向阳极端的精子用于人工授精的结果，在黑毛和牛中得到42头母19头公的性比，然而在黑白花奶牛中却得到9∶9的性比。由此可见，根据X、Y精子的膜电位差所进行的电泳分离法的结果，还有待于进一步的验证。

4.免疫学方法

Goldberg等(1971)由抗H－Y抗体的小白鼠精子的细胞毒性试验证明，H－Y抗原具有特异性。如果H－Y抗原仅在Y精子存在，或者Y精子的H－Y抗原量比X精子多，那么可由H－Y抗体作用于Y精子达到分离X、Y精子的目的。然而用H—Y抗血清处理精子的结果，却不太理想。Bennett和Boyse(1973)把由小白鼠附睾和输精管采得的精子，用H—Y抗血清处理后进行输精，其结果所产雄仔鼠的比率为45.4％(对照组为53.3％)。有人用单克隆抗体法进行试验，所产仔鼠的性比也未出现明显的变化。但是，Bryant(1980)用含抗体的免疫吸附层析柱分离小白鼠的X精子后输精结果，所产雄仔鼠的比率为4.2％(对照组为46.6％)。Zavos(1983)报道，把H—Y抗血清注入到兔阴道内后输精，所产仔兔的74.2％为雌性，较对照组的50.6％明显增高。

有人报道，Y精子较X精子所含H—Y抗原多，亦有人推测单倍体基因组与H—Y抗原的产生有关，然而对此也有否定的报告。

5.其他分离法

也有使用离子交换层分析柱或葡聚糖分离X、Y精子的实验报告，但其结果极不一致。有人报道用离子交换层析柱分离人精子，分离精子的98.4％为F小体阴性，然而在牛追试产犊结果，其性比差异不显著。Steeno等(1975)报道，用葡聚糖G—50分离人精子的结果，开始随灌流液流出层析往的精子F小体的检出率为4.7％，相反滞留在层析柱中的精子F小体的检出率为65％。然而，亦有人报道这种分离方法完全无效。

三、分离实验的评价

通常把具有F小体的人精子判定为Y精子。然而，在家畜精子不但F小体阳性精子就是Y精子的证据不足，而且对于是否具有F小体也尚无定论。所以为鉴定家畜精子的分离效果，必须进行受精试验，检查受精卵的染色体，或者由所产仔畜的性比加以证明。

最近，有人报道可用流式细胞光度仪鉴别X、Y精子。Pinkel等(1985)研制出用这种仪器测定精子DNA的方法，由此来鉴别各种不同分离方法的效果，证明各种分离方法均为无效。

人们已清楚X、Y精子在性染色体上的DNA量具有差异。即使两种精子间还具有其他差异，也极易被各种因素的影响所掩盖。最近，Ueda和Yanagimachi(1987)报道，使人精子侵入仓鼠的卵内检查精子性染色体的结果，证明精子Y染色体的检出率与F小体的阳性率大体一致。也许这—方法是鉴别分离效果的有效办法。人们由分离X、Y精子来控制仔畜的性比，目前来看其实验结果亦有很大的偶然性，为此对于分离方法还需要进一步研究和探讨