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非水介质中的酶催化

     传统理论认为，酶作为生物催化剂，在体外只能在水溶液环境才保持活性，而有机溶剂中酶则往往变性或失活。然而人们发现事实并非如此。如向酶溶液中加入能与水互溶的酒精、丙酮等，或制作乳化的酶水有机溶剂两相系统，甚至在几乎无水的有机介质中，酶仍能够具有催化活性。证明了非水有机介质中，酶仍能进行催化反应。并且还具有与水溶液系统不同的一些奇异特性。本文就此作一简单介绍。

    所谓非水介质并不是绝对无水，一般指水含量低于0.01％以下。酶维持活性有赖于其活性构象的维持，而酶的活性构象的形成是依赖于各种氢健、疏水健等非共价相互作用。水参与了氢健的形成，而疏水相互作用也只有在有水参与时才能形成。因此水分子与酶分子的活性构象形成有关。其实与酶分子起作用的只是与酶分子紧密接触的一层束缚水，只要保证这些基本必需的水分子固定在酶分子表面，而水溶液中其他大部分的自由水尽可以被有机溶剂所代替，有研究表明：在不同极性有机溶剂的低水反应介质中，随着溶剂的亲水性增大，保持在糜蛋白酶表面的束缚水下降2.5％～1.0％，而酶活性随之下降了10000倍。酶在完全干燥的溶剂中通常没有活性。所以体系中有足够的水分对酶的催化起着重要的作用。有人认为，酶的活性取决于被酶分子吸附的水分而与溶剂中的总净水含量无关。表现活性所需的水量因酶而不同，脂肪酶似乎只需几个水分子，糜蛋白酶吸附了50个水分子后就能够在辛烷中显示活性。枯草杆菌蛋白酶也大致如此，对这些酶分子来说，要在其表面形成分子层水膜，则需大约500个水分子。水与酶蛋白分子表面的带电部位和部分极性基因的水合可能是酶催化的先决条件。设想在无水条件下，酶分子的带电基团和极性基团相互作用产生一种非活性的封闭结构，加入的水能使酶分子的柔性增大，并通过非共价作用力来维持其催化的活性结构。实验表明，水合作用能促进酶反应，而过量的水会导致酶活性下降。

    选择什么样的有机介质，对酶的催化活性影响很大。此外，有机溶剂还能够改变酶的底物专一性，原因是有机溶剂可以与酶分子表面的水相互作用，或影响底物与产物在有机相和水相的分配，以及对酶的抑制和失活作用。一般认为，疏水性的有机溶剂是最好的反应介质。溶剂的疏水性越大，溶剂与酶分子争夺水分子的能力越小，保留在酶分子表面的水分越多，酶活性也就越大。通常以lgP即一种溶剂在辛醇/水两相之间的分配系数的常用对数值，来表示溶剂的疏水性。实验表明，在加入等量水的情况下，溶剂的lgP值越高，酶的活性越大。要达到一定的酶活性，不同溶剂所需的水量也不一样。

    有机溶剂的选择必须考虑3个因素：(1)溶剂对酶反应的影响(包括对底物的溶解能力，对反应平衡点、动力学及酶专一性的影响)；(2)溶剂的毒性(对食品工业和药物生产特别重要)；(3)对酶稳定性的影响。可供试验选用的有：辛烷、甲苯、异丙基醚、甲基异丁酮、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、四氢呋喃和乙腈等。

    3．1 稳定性提高 试验表明许多酶在有机溶剂中比在水中稳定。有人发现糜蛋白酶在100℃的辛烷中半寿期达数小时，而在水溶液中温度升至60℃时酶即在数分钟内不可逆失活。枯草杆菌蛋白酶和猪胰腺脂肪酶在非水有机介质中可忍受100℃以上的高温。酶的热稳定性随含水量升高而降低。酶变性失活包括有较大的构象改变，在酶构象改变中需要有自由水的存在，因此酶的构象改变和热诱导变性应为脱水所抑制。结构分析表明，酶在有机介质中确实具有刚性结构。酶的贮藏稳定性在有机溶剂中亦明显提高，如糜蛋白酶在20℃辛烷中长达半年仍保持全部活性，而在水中其半寿期只有几天。

    3．2 pH记忆和分子印记 酶在有机溶剂中能保持其制备的pH不变，可记忆其制备时的pH值。这也与酶在有机溶剂中的刚性结构有关。因此在制备酶制剂时应将pH值调至反应的最适pH值以便获得最大酶活性，而且发现从含有一种竞争性抑制剂的水溶液中制备枯草杆菌蛋白酶后除去抑制剂，酶在有机介质中表现的活性比从不含抑制剂的酶溶液冻干制备的酶高出100倍。说明由竞争抑制剂导致的酶构象变化除去抑制剂后在无水条件下仍能保持。这种由配体诱导的“酶记忆”可扩展到酶的稳定性、亲和力及底物专一性上。这也提供了一种对酶前处理途径。

    3．3 底物专一性的改变 在水溶液中，水分子与酶分子对底物分子的竞争性结合决定酶的底物专一性。当用有机溶剂代替水时酶的底物专一性就会发生改变。如酶对极性底物和非极性底物的专一性发生逆转，对对映体的专一性降低。

    3．4 新的酶促反应的产生 在非水有机溶剂中酶可催化一些在水溶液本不可进行的反应，如酯酶可催化一系列反应，包括酯化反应、转酯反应、胺解反应、转硫酯反应等等，而在水中这些反应均为水解反应所代替。枯草杆菌蛋白酶可催化糖类的酰化。酪氨酸酶所催化的酚类物质氧化，在水溶液中由于产物醌类的聚合并引起酶的失活，产率很低，在氯仿中反应可以持续进行。

    3．5 酶促动力学变化 酶在非水介质中的反应符合Michaelis-Menten公式，影响有机介质中酶促反应动力学变化的因素涉及底物和溶剂的性质。酶和溶剂竞争底物，如果底物与溶剂的亲和性高，则底物与酶的亲和力低，Km大；如果底物与溶剂的亲和力低，则酶与底物的亲和力相应增高，Km变小。根据相似相溶的原则，极性溶剂中，非极性底物比极性底物有更低的Km和更高的反应速度。在极性溶剂中则相反。

    非经特殊处理，在大多数有机溶剂中，蛋白质是高度不溶的。因此，酶在有机溶剂中以两种形式存在。这有利于酶和产物的回收和酶的重复使用，但底物和产物的扩散会受到限制。通常制备能在有机介质中反应的酶有几种方法：(1)冻干法 最常用。通过改变温度和压力，能调节酶的水合度；通过调节制备缓冲液的离子组成、离子强度和pH值，能够调节酶干粉的离子吸附和pH值。酶分子能“记忆”住制备的pH值，并在有机溶剂中保持不变；(2)沉淀法 常用经典的丙酮沉淀法；(3)固定化酶 常用吸附法。在非水反应介质中，固定化酶可以减少扩散限制。固定化酶载体的疏水性对酶活性和反应速度有影响。一般采用疏水性大的材料作载体。

    已有研究结果表明，酶在有机介质中能起催化作用，且催化活性与水溶液中相当甚至超出，并且能够表现出与水溶液中不同的性质和优越性：如有利于疏水物质的反应；催化在水中不能进行的反应；减少由水引起的副反应(如水解反应)，使反应平衡向所需方向移动；以及控制底物的专一性，酶的稳定性可以得到提高；减少微生物的污染；还有利于产物的回收，提高产率这些特点可以在实践中加以应用。

    5．1 肽合成 蛋白水解酶催化的正常反应是蛋白质的水解，在非水有机介质中其反应平衡趋向逆过程即肽的合成。该技术已用于合成甜味二肽及脑啡肽，非水介质不但改变了平衡点，而且不需要通常多肽合成时必需的基团保护。

    5．2 脂肪酶的多功能催化 在有机介质中脂肪酶具有多种功能，其中包括：水解、转脂、脂化、氨解等。在工业化应用中可通过脂肪酶催化一种较便宜的食用油向可可油的转化以生产可可脂。利用脂肪酶的多功能催化作用还可进行外消旋体的光学拆分，二元醇、甾体和糖类的区域选择性酰化，酚类的聚合等。

    5．3 非天然物质的合成与转化 酶在有机溶剂中的催化性能不仅表现在天然底物上，对一些非天然有机物质也可进行酶促合成与转化，如酶法聚合酚醛树脂，D-氨基酸的酶促合成。酶在有机介质中的催化研究为酶工程开辟了一个崭新的领域，其应用方兴未艾，前途广阔。