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植物基因的直接转移方法

植物基因的转移虽然可以用农杆菌的质粒作为载体，但是农杆菌的质粒对于禾谷类单子叶植物的侵染率很低，难以在基因转移中实际应用。因此，对不用载体而直接进行植物基因转移的研究越来越引起科学家的重视，并取得了重大进展。直接转移的方法目前有以下几种。

微注射法  首先将植物细胞游离出原生质体。用特制的仪器制成一个一端能容纳单个原生质体的小喇叭口，另一端连接一根微管，与弱抽气装置连接，形成负压。然后，在倒置显微镜和显微操作器的帮助下，在培养皿中用喇叭口端将单个原生质体吸住，另取一个口径约0.5～1 μm的微管，刺入原生质体中；这个微管的另一端连有一个微注射器，将目的基因DNA通过微管注射到受体细胞中。这种方法的操作技术要求严格，必须在特制的无菌显微操作室中进行，而且注射效率低，对受体细胞易造成损伤。所以，现在已很少使用，但仍在动物细胞试验中广泛使用。

电穿孔法  研究发现，原生质体在短时间的高压直流电脉冲的冲击下，可以使原生质膜的分子疏松，形成暂时性的直径为3～4 nm的小孔，但对原生质体生活力影响不大。这时，存在于原生质体周围溶液中的外源DNA，就可以通过这种小孔进入原生质体，实现基因的直接转移。这种方法转移基因的效率较高，操作简便，现在已为大多数研究者采用。

微束激光打孔法  这种方法与电穿孔法类似，原生质体在短时间的微束激光照射下，也可在质膜表面形成面积约0.25 μm²左右的小孔，使DNA分子进入细胞。但与电穿孔法相比，这种方法所用的仪器复杂，对操作技术的要求高，难掌握。操作不当会对细胞产生较大的伤害，若形成的小孔无法恢复，原生质内容物流出后会引起细胞死亡。目前只有少数有条件的单位采用。

基因枪法  基因枪是一种专门的用于基因转移的高压枪，可以把平均直径约为4 μm的钨等金属粒子射入细胞中，若将目的基因的DNA附着在金属粒子表面，就可以实现基因的直接转移。这种方法的优点是金属粒子可以穿透细胞壁，所以可以用细胞或组织直接操作，不需要先游离原生质体，给基因转移提供了便利。例如，据国外1992年报道，美国佛罗里达大学和孟山都公司合作，把抗广谱除草剂Basta的Bar基因用基因枪导入小麦胚性愈伤组织，获得了转基因小麦。我国也开展了这方面的研究，并取得了一些研究成果。最近，国外又研究出了用高压微束液流注射代替金属粒子注射的新型基因枪，具有更好的效果。

基因的直接转移方法扩大了植物基因转移的范围，特别是对原生质体培养比较困难的禾谷类作物更是如此，因而受到人们的重视。植物基因直接转移中存在的问题是外源DNA进入细胞后会不会被细胞中的核酸酶所分解，及能否整合到植物染色体中并与植物细胞一同进行复制、转录和翻译等。为了解决这些问题，有的研究者将目的基因与改建后的农杆菌质粒组成重组DNA分子，然后再将它们用直接转移方法，转移到植物细胞中，获得了较好的效果。